Biochemisches Großpraktikum II, Teil B (Cellular Biochemistry)
In den beiden ersten experimentelle Wochen „Arabidopsis thaliana Mutantenanalyse“ und „Pflanzentransformation“ sollen grundlegende, im wissenschaftlichen
Alltag eingesetzte, molekulare,
proteinbiochemische und zellbiologische Methoden für die Modellpflanze Arabidopsis thaliana vermittelt werden. Es
werden segregierende Nachkommen einer heterozygoten T-DNA Insertionsmutante phänotypisch
und genotypisch untersucht. Dabei wird die Auswirkung der Mutation auf
Organ-Ebene ermittelt. Das von der T-DNA Insertion betroffene Gen wird durch
eine (eigenständige) Sequenzhomologiesuche identifiziert. Unter Verwendung kleinster
Mengen von Pflanzenmaterial wird der Effekt der T-DNA Insertion auf die Transkription des betroffenen
Gens mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Zur Bestimmung der
subzellulären Lokalisation des vom betroffenen Gen kodierte Proteins wird eine Agrobacterium tumefaciens-vermittelte
Pflanzen-Transformation von Tabak-Blättern durchgeführt. Mittels Konfokaler
Laserscanning-Mikroskopie wird das Protein anschließend unter Einsatz von
co-transformierten Markerproteinen subzellulär lokalisiert. Zusätzlich wird die
Methode der PEG-vermittelten Protoplasten-Transformation erlernt. Die
transformierten Protoplasten werden anschließend für Protein-Protein
Interaktionsstudien in vivo über BiFC und ein Co-IP Experiment eingesetzt. Während
der dritten experimentellen Woche „Von der
Genexpression zu Proteinen und RNA" wird die rekombinant in E. coli exprimierte T7-RNA-Polymerase aufgereinigt,
gefolgt von einer Proteincharakterisierung durch SDS-PAGE und Western Blot. Ihre
enzymatische Aktivität wird bewertet durch In-vitro-Transkription und
RNA-Reinigung, einschließlich der Transkriptanalyse durch Gelelektrophorese.
Im Praktikum
angewandte Methoden:Agrobacterium-vermittelte
Pflanzentransformation; PEG-vermittelte Protoplastentransformation; Untersuchung
einer Arabidopsis thaliana T-DNA
Insertionsmutante; mRNA Direct; RT-PCR; Herstellung von Phasenpräparaten; ZEISS
Apotome; Spinning Disc CLSM;
BiFC; Co-IP; In-vitro Transkription; RNA-Reinigung; Transkriptanalyse.
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Biochemical practical course II, part B (Cellular Biochemistry)
In the first two experimental weeks, “Arabidopsis thaliana mutant
analysis” and “Plant transformation”, basic molecular, protein
biochemical and cell biological methods used in everyday science for the model
plant Arabidopsis
thaliana will be learned. Segregating progeny of a heterozygous
T-DNA insertion mutant will be analyzed phenotypically and genotypically. The
effect of the mutation on the organ level is determined. The gene affected by
the T-DNA insertion is identified by an (independent) sequence homology search.
Using very small amounts of plant material, the effect of the T-DNA insertion
on the transcription of the affected gene is investigated by semi-quantitative
RT-PCR. Agrobacterium
tumefaciens-mediated plant transformation of tobacco leaves will be
performed to determine the subcellular localization of the protein encoded by
the affected gene. Confocal laser scanning microscopy is then used to localize
the protein subcellularly using co-transformed marker proteins. In addition,
the method of PEG-mediated protoplast transformation is learned. The
transformed protoplasts are then used for protein-protein interaction studies
in vivo via BiFC and a Co-IP experiment. During the third experimental week
"From
gene expression to proteins and RNA", the recombinant T7 RNA
polymerase expressed in E. coli will be purified, followed by protein
characterization by SDS-PAGE and Western blot. Its enzymatic activity will be
evaluated by in vitro transcription and RNA purification, including transcript
analysis by gel electrophoresis.
Methods applied in the practical course:Agrobacterium-mediated
plant transformation; PEG-mediated protoplast transformation; plant genomic DNA
isolation; PCR-based T-DNA mutant characterization; mRNA Direct; RT-PCR;
preparation of phase preparations; ZEISS Apotome; spinning disk CLSM; BiFC;
Co-IP; in vitro transcription; RNA purification; transcript analysis.
